PCR扩增试验的动力学数学模型

    PCR扩增试验的动力学
    数学模型

    克丙申1、黄象艳2、陈士敏2、陈英剑2、沈柏均1

    （1 山东脐血造血干细胞库 250002 2济南军区总医院 250031）

    摘要：PCR技术已日趋成熟，但因为影响因素较多、反应过程比较复杂, 直到目前PCR技术已创立近二十年，尚未能给出较好的描述PCR 反应的数学方法。我们根据它的基本原理提出了能够描述其反应过程的动力学方程：Wamp=[Ntarg(1+P)n1+0.5CenzUPCeactiv(n-n1)–Ntarg (1+np)]CuM，准确地描述了PCR反应的产物积累规律，建立了PCR反应的动力学数学模型。用动力学数学模型预测的PE 7700仪器的CT值与仪器的实际数值一致。动力学数学模型配合适当的监测设备可以构成自动化的PCR 定量仪器。PE 7700 仪器使用本动力学模型处理、分析数据，定量结果的准确性会更好。各实验室可根据各自的实验条件，由模型估算PCR产物数量，为PCR后产物继续处理提供较准确的数量信息。本模型阐明了PCR反应在多次循环后必然由指数扩增转变为线性扩增的分子基础，为定量PCR 提供了准确的计算方法。
    关键词：数学模型、PCR动力学、定量PCR 、动力学方程


    自1983年MuLLis构思PCR(Polymerase Chain Reaction)技术, 1985年美国Science杂志首刊Saiki等使用PCR方法做出镰形红细胞贫血基因诊断以来, PCR技术已成为医学乃至整个生命科学极为有用的研究工具。PCR技术已日趋成熟，但因为影响因素较多, 反应过程比较复杂, 直到PCR技术已创立十多年之后，国际上的科学家尚未能给出较好的描述PCR 反应的数学模型。我们根据PCR技术的基本原理提出了比较完整、比较准确地描述PCR扩增技术的动力学数学模型，使 PCR 技术的理论研究达到了一个新的水平。
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    作者简介: 克丙申 (1947年) 男(汉族)、河南省荥阳县人,主任技师,从事免疫学方面的工作。在PCR、核酸序列分析、人白细胞抗原核酸序列分型技术（HLA-SBT）方面有专长。
    E-mail：kbshen@sina.com 电话 0531-5942949 （H），0531-2187681-66960 （O）

    1、理论依据与方程的推导：
    PCR反应的特点主要是模板变性、引物结合、引物延伸三个步骤反复循环。每经过一个循环, 模板数会增加1倍或者接近1倍[1-3]。在每一个循环中, 一条双链模板可变性分离为两条单链, 经过Taq酶延伸结合在模板上的引物产生两条双链[2，4], 这是PCR反应的最基本的数量关系。因此在最初的有限次循环内，系统中模板的数量可用:
    Namp=Ntarg(1+P)n ⑴ 表示。
    这里Ntarg是初始模板数量，P表示系统的平均扩增效率，n为循环次数。由於PCR是酶促反应, 因此它应具有酶促反应动力学的特点[5]。从反应的基本数量关系分析, 一条双链转化为2条双链,应有2个酶分子参与反应。这样就有了酶分子数量与模板数量的基本关系。由于投入反应体系中的酶单位是有限的, 所以反应体系中的酶分子数目不是无限的。从酶反应动力学角度分析，在反应的初期, 体系是处於酶过量的状态, 而在反应后期, 体系则是处於底物过量状态。经查阅当时的资料, 提供的Taq酶的分子量为94,000、最纯的酶为每毫克蛋白200,000单位[2], 从而计算出1u Taq酶应具有3.2×1010个酶分子。这就是说，当体系中加入2单位的Taq, 系统中模板数量达到3.2×1010 时，下一次循环及以后的循环就不可能再呈指数形式的扩增状态，而只能呈线性扩增状态, 而且每次循环新产生的产物分子数目不会超过3.2×1010个分子(双链)，这就是它的内在的、基本的数量关系。这样的一个规律, 就可以用:
    Namp=Ntarg(1+P)n1 + .5CenzUP(n n1) ⑵ 表示，
    其中 Namp代表系统中可利用的模板的数量，Cenz酶分子常数3.2×1010，U 投入反应体系的酶单位，n1 模板数大于、等于体系酶分子数一半时的循环次数，n 循环次数，n    T=e（a+bTemp） ⑶，
    a、b为方程系数，Temp 变性温度。可计算出在PCR反应过程中受高温影响酶失活的数量为：
    0.5(nTime + Ptime)/e(a+bTemp) ⑷，
    Time 循环中的变性时间，Ptime 预变性时间。系统中具有活性的酶的数量为：
    1 - 0.5(nTime + Ptime)/e(a+bTemp) = Ceactiv ⑸。
    这样，公式就可修改为:
    Namp= Ntarg(1+P)n1 + .5 Cenz U P Ceactiv (n n1) ⑹,
    n1 可由2Ntarg(1+p)n CenzUCeactiv = 0 ⑺
    求出, n1 表示了最后一次指数形式扩增的循环次数。而限定长度的扩增产物数量为：
    Namp=Ntarg(1+P)n1+.5CenzUPCeactiv(nn1)–Ntarg(1+Pn) ⑻ 。
    根据反应速率的基本概念,可借用下式来描述PCR反应产物分子数目积累的速率。
    Vrate=dNamp/dn ⑼
    Ntarg(1P)nln(1P)-PNtarg n<=n1
    =
    0.5CenzUP{1[Time(2nn1)+Ptime]/[2e(a+btemp)]}-PNtarg
    n2>=n>n1

    扩增产物使用重量表示时，可使用：
    Wamp=[Ntarg(1+P)n1+0.5CenzUPCeactiv(n-n1)–Ntarg(1+Pn)]CuM ⑽
    来表示。至此, 方程中包括了以下的变量（或因素）：
    Ntarg 初始模板数量 Ptime 预变性时间
    P 平均扩增效率 n 循环次数
    n1 方式转换参数 Cenz 酶分子常数（3.21010 ）
    M 扩增片段分子量 Time 变性时间
    U 投入系统的酶单位 L 扩增片段长度
    Temp 变性温度 Cu 转换系数（1.6610-18）
    Ceactiv 酶活性系数 1-0.5(nTime+Ptime)/e(a+bTemp)）

    方程中包括了13个与PCR有关的因素, 准确地描述了PCR反应的产物积累规律，建立了PCR 反应的动力学数数学模型。(n2 是极限循环次数，可由1-0.5(nTime+Ptime)/e(a+bTemp) =0 计算)


    2、模型的验证：

    2．1 动力学方程描述的函数图象与PCR原理的一致性
    表1. PCR 反应的化学动力学分析
    Table 1. Chemical kinetics analysis of PCR
    ---------------------------------------------------------------
    N Wamp (g) Times C (g/10l) Vrate Fs
    ---------------------------------------------------------------
    1 1.35456E-08 0 2.70912E-09 1.988094 0
    2 3.860496E-08 .7225 7.720992E-09 2.955473 0
    5 3.293969E-07 16.41999 6.587938E-08 14.18107 0
    10 7.467424E-06 460.0884 1.493485E-06 289.734 .0002
    15 1.621484E-04 10162.22 3.242968E-05 6260.963 .00444

    20 3.514083E-03 220495.2 7.028166E-04 135657.4 .09628
    25 .022715 1425368 4.543001E-03 242548.7 .62239
    30 .0408647 2564276 8.172941E-03 213017.7 1.1197
    35 .05666137 3555528 1.133227E-02 183486.7 1.55253
    40 .070105 4399126 .014021 153955.8 1.92089
    ---------------------------------------------------------------
    Ntarg= 50000 P= .85 Nprim= 10 Pmol
    Enzym U= 1.25 u Lamp= 300 bp n1= 21
    Vamp= 50 l Temp= 94 Ct= 23
    Wamp= .3651274 Pmol Wamp= 7.010446E-02 g Ptime= 4



    图1.PCR动力学方程描述的PCR产物积累曲线（Wamp）与产物积累速率曲线(Vrate)
    Fig 1. Kinetic curve of PCR amplification
    根据PCR原理建立的动力学方程是否正确尚需要证实。由PCR动力数学模型计算的一次PCR反应的动力学资料列在表1中。由表1的动力学资料绘出的产物积累曲线如图1。从图1中的产物积累曲线可以看出, 在反应的初期产物数量是很少的,在进入线性扩增后的10多次循环中产物大量增加,并且随着时间的延长,积累的速度在逐渐降低,这一规律, 与PCR的原理是一致的。动力学曲线给予的启示是, PCR反应的产物积累最有效的时期是在线性扩增状态的10-20次循环以内。根据动力学模型的计算结果可以确定PCR反应产物的大概数量，确定电泳时需要的上样体积（8）以及是否能满足后续处理的需要。
    2．2 动力学方程与Saiki试验结果的对比
    Saiki 1985年发表在《Science》杂志的论文中[9]，参考文献部分有一段文字说明是:以36ng的人基因组DNA(相当于1.8×10-8pmol)作为初始模板, 1 U Taq进行扩增,20个循环, 测定得到4.0×10-3pmol的扩增产物, 计算出PCR的平均扩增效率为0.85。根据人的单倍体细胞基因组计算, 36 ng DNA相当于10836 个白细胞DNA, 即起始模板数是10836, 用模板数10836, P=0.85, 1 U Taq酶,(94℃变性温度) 代入方程20次循环计算的扩增产物理论值是3.966×10-3 pmol, 与其测定结果4.0×10-3pmol基本一致。这一结果的符合程度, 初步证明了PCR动力数学模型是正确的。根据动力学模型计算的每一循环获得的产物数量列在表2中。
    表2. PCR 反应的化学动力学分析（Lamp= 300 bp 计）
    Table 2. Chemical kinetics analysis of Saiki’s data
    ------------------------------------------------------------------
    N Wamp(g) Times C(ug/10l) Vrate Fs
    ------------------------------------------------------------------
    1 0 0 0 .2880933 0
    2 2.495262E-09 .7225 4.990524E-10 1.255473 6.781488E-08
    3 9.60676E-09 2.781625 1.921352E-09 3.045125 2.610873E-07
    4 2.525829E-08 7.313506 5.051658E-09 6.355981 6.864562E-07
    5 5.670888E-08 16.41999 1.134178E-08 12.48106 1.541203E-06

    6 1.173877E-07 33.98948 2.347755E-08 23.81247 3.190301E-06
    10 1.588984E-06 460.0884 3.177968E-07 288.034 4.318455E-05
    15 3.509676E-05 10162.22 7.019352E-06 6259.262 9.538408E-04
    20 7.615133E-04 220495.2 1.523027E-04 135655.7 .020696
    ------------------------------------------------------------------
    Ntarg= 10836 P= .85 Nprim= 10 Pmol
    Enzym U= 1 u Lamp= 300 bp n1= 23
    Wamp= 3.966215E-03 Pmol Wamp= 7.615133E-04 g


    2．3 PCR动力学数学模型计算结果与PE7700实时定量系统测定的结果比较
    1996年, 美国PE公司推出了7700实时定量系统，为PCR定量技术提供了崭新的技术手段。其基本原理是利用双标记荧光探针, 结合在扩增片断的中间, 利用Taq酶5’-3’的外切酶活性, 酶解探针, 从而使标记在探针上的发射荧光分子与淬灭荧光分子分离而发射荧光, 这样体系中发射荧光的强度与系统中真正由扩增反应产生的产物分子数量相一致。使用这种方法计算系统中的起始模板数量, 实现了PCR定量技术。它的荧光强度即是系统中积累的发射荧光分子数量的总效应, 根据它的原理, 每增加一条双链, 就有一个发射荧光分子产生, 所以系统中发射荧光的强度代表了PCR扩增产生的产物数量。7700实时定量系统荧光强度的渐增与动力学描述产物积累的概念是一致的, 如果PCR动力学数学模型能计算出7700实时定量系统的荧光强度，预测7700不同模板数量的CT数值，则表明PCR动力学数学模型是基本正确的, 它描述的反应过程代表了PCR 反应本身产物积累的实际规律。使用PCR动力学数学模型预测的7700不同模板数量的CT数值与7700的实际CT 比较见表3。使用PCR动力学预测的7700的CT数值与7700的实际域值两者的结果是相一致的，这一结果说明使用PCR动力学数学模型可以预测7700的CT数值。
    表3. PCR动力学预测的CT值、CT值时系统中的分子数、荧光强度及n1值
    Table 3. Predicted CT value of PE 7700 by the kinetic-mathematical model
    ------------------------------------------------------------------
    7700域值动力学预预测的达Ct值达Ct值时动力学预
    模板数（Ct值）测的Ct值时的分子数的荧光强度测的n1值
    -----------------------------------------------------------------
    1 40.2 41 4.521010 0.395 38
    10 36.4 37 4.431010 0.387 35
    100 32.7 33 4.221010 0.368 31
    500 30.1 30 3.911010 0.341 28
    1000 29.0 29 4.061010 0.354 27

    5000 26.4 26 3.651010 0.318 26
    10000 25.3 25 3.851010 0.336 24
    100000 21.6 22 4.831010 0.422 20
    1000000 17.9 18 4.631010 0.404 16
    10000000 14.2 14 4.391010 0.384 13
    ----------------------------------------------------------------
    注： CT值是指荧光定量技术中，由PCR反应过程产生的荧光达到仪器可测定的、确定的荧光强度时的循环次数。研究发现CT值与模板数量间有函数关系。


    2．4 PCR动力学数学模型计算结果与实时定量测定的动力学资料的比较
    在早期的实时定量PCR技术宣传资料中有如图2所示的一组资料。反映了当时的PE公司进行的一组由1000、2000、5000、10000以及20000模板数进行的实时测定资料。由于加样误差的

    图2 1000、2000、5000、10000、20000 模板

    表4 动力学模型计算的2000模板数时的各循环数相应的荧光值资料
    ---------------------------------------------------------------------------
    循环数荧光值循环数荧光值
    ---------------------------------------------------------------------------
    1 .0000000148461 21 7.12522671740228E-03
    2 .000000042311385 22 1.31816842732942E-0
    3 9.312216225E-08 23 2.43861307516943E-02
    4 1.871221001625E-07 24 4.51143567367345E-02
    5 3.61021985300625E-07 25 8.34615748090587E-02

    6 6.82736772806157E-07 26 .154403928242859
    7 1.27790912969139E-06 27 .246128121397057
    8 2.37897798992907E-06 28 .337852314551255
    9 4.41595538136878E-06 29 .429576507705454
    10 8.18436355553225E-06 30 .521300700859652

    11 1.51559186777347E-05 31 .61302489401385
    12 2.80532956538091E-05 32 .704749087168048
    13 5.19134430595469E-05 33 .796473280322247
    14 9.60547157601617E-05 34 .888197473476445
    15 1.77716070256299E-04 35 .979921666630643

    16 3.28789576074153E-04 36 1.07164585978484
    17 6.08275561837184E-04 37 1.16337005293904
    18 1.12532463549879E-03 38 1.25509424609324
    19 2.08186542177276E-03 39 1.34681843924744
    20 3.85146587637961E-03 40 1.43854263240163
    --------------------------------------------------------------------------
    注：图2中蓝色线条表示的曲线资料



    表5 动力学模型计算的20000模板数时的各循环数相应的荧光值资料
    ----------------------------------------------------------------------------
    循环数荧光值循环数荧光值
    ----------------------------------------------------------------------------
    1 .000000148461 21 7.12522671740228E-02
    2 .00000042311385 22 .131816842732942
    3 9.312216225E-07 23 .243861307516943
    4 1.871221001625E-06 24 .335585500671141
    5 3.61021985300625E-06 25 .42730969382534

    6 6.82736772806156E-06 26 .519033886979538
    7 1.27790912969139E-05 27 .610758080133736
    8 2.37897798992907E-05 28 .702482273287934
    9 4.41595538136878E-05 29 .794206466442133
    10 8.18436355553225E-05 30 .885930659596331

    11 1.51559186777347E-04 31 .977654852750529
    12 2.80532956538091E-04 32 1.06937904590473
    13 5.19134430595469E-04 33 1.16110323905893
    14 9.60547157601617E-04 34 1.25282743221312
    15 1.77716070256299E-03 35 1.34455162536732

    16 3.28789576074153E-03 36 1.43627581852152
    17 6.08275561837184E-03 37 1.52800001167572
    18 1.12532463549879E-02 38 1.61972420482992
    19 2.08186542177276E-02 39 1.71144839798412
    20 3.85146587637961E-02 40 1.80317259113831
    --------------------------------------------------------------------------
    注：图2中黑色线条表示的曲线资料


    存在，导致每反应管的模板数存在差异，使同时进行的实验测定曲线不能完全一致。由图2可以看出，实验的重复性是好的。表4、5列出了由本动力学模型计算的2000、20000模板数时相应与PE7700仪器的各循环数的荧光数值资料，与图2所显示的数据是非常一致的。这基本上说明本文提出的动力学模型可以描述PCR反应的过程。就目前的文献资料看，除本动力学模型外，尚没有其它动力学模型可以全程描述PCR反应的过程，而且动力学参数的物理意义亦不明确。
    2.5 与Christian Ramakers 文献资料的对比
    Christian Ramakers 2003年在神经科学文献 339期 62-66 上发表论文提供了他们使用的仪器的一组资料，根据他提供的资料使用免标准曲线方法分析出，他们的这一组资料的起始模板数是113198，扩增效率是0.821, 使用动力学模型模拟分析的结果列在表6中，模拟分析使用的条件标注在表6下方。分析结果的误差列在表7中。由分析结果可以看出，动力学模型，可以准确的描述出PCR反应的动力学规律。
    表6 动力学模型描述的全程反应的各循环数的荧光数值
    -------------------------------------------------------------------
    循环数荧光强度循环数荧光强度
    --------------------------------------------------------------------

    1 9.319863E-07
    2 9.566212E-06
    3 3.283382E-05
    4 8.261081E-05
    5 1.805234E-04
    6 3.65953E-04
    7 7.106128E-04
    8 1.345093E-03
    9 2.507199E-03
    10 4.629973E-03
    11 8.501982E-03
    12 1.555922E-02
    13 2.841661E-02
    14 5.183594E-02
    15 9.448842E-02
    16 .1721644
    17 .3136179
    18 .5712102
    19 1.040291
    20 1.894493
    21 3.449998
    22 5.991
    23 8.474986
    24 10.90196
    25 13.27191
    26 15.58485
    27 17.84078
    28 20.03968
    29 22.18158
    30 24.26645
    31 26.29431
    32 28.26516
    33 30.17898
    34 32.0358
    35 33.8356
    36 35.57838
    37 37.26415
    38 38.8929
    39 40.46464
    40 41.97936

    -----------------------------------------------------------------------
    模板数= 113198 n1=21 Fci=1.0411E-10 变性温度= 94
    Taq =2.4 u P= .821


    图 2 自文献复制的资料图片

    表7. 模拟资料与文献资料的对比分析
    -------------------------------------------
    循环数文献数值模拟数值误差%
    -------------------------------------------
    15 0.098 0.0946 -3.47
    16 0.171 0.1722 0.70
    17 0.318 0.3137 -1.35
    18 0.562 0.5713 1.65
    19 1.05 1.0404 -0.95

    20 1.93 1.894 -1.86
    21 3.44 3.450 0.29
    22 5.98 5.991 0.18
    ------------------------------------------

    3 讨论
    根据PCR反应的基本原理建立的数学模型, 经与多种实验数据的对比分析, 尤其是与7700实时PCR定量系统的对比分析说明建立的PCR 动力学数学模型是基本正确的。这一模型科学地解释了关於PCR反应，为什么会在一定的循环次数后，由指数扩增方式转变为线性扩增的必然性, 阐明了其分子基础，完善了PCR技术理论, 使PCR技术成为比较成熟的科学技术。并为PCR 技术的进一步开发应用奠定了理论基础，为PCR产物定量与定量PCR技术提供了基本的理论根据。
    在此以前的动力学方程，只能适应指数扩增期的计算，本模型适应对扩增的全过程进行计算。本研究提供的PCR动力学数学模型比目前国际上已有的模型更好、更符合它的基本原理[10,11]。该模型可以用于各实验室根据各自的实验条件估算他们的PCR产物数量，为 PCR后产物处理提供产物数量信息[12]。亦可以根据他们的 PCR产物数量及反应条件计算相应的PCR参数。本动力学数学模型结合适当的测量设备可以构成自动化的PCR 定量仪器。PE 7700 仪器使用本动力学模型处理、分析数据，定量结果的准确性会更好。更适合PE 7700 仪器使用的动力学模型是：
    Fs=[Ntarg(1+P)n1+0.5CenzUPCeactiv(n-n1)–Ntarg]fc
    Fs 荧光强度，fc 分子荧光系数，即一个荧光分子的荧光强度。
    模型的验证部分,用本模型计算了Saiki发表在《Science》文中的数据，计算结果与其实验结果一致，即实验结果4.010-3 pmol，计算结果3.96610-3 pmol，结果非常符合。计算了PE公司7700定量系统的自一个模板至一千万个模板之间的CT值,都与定量系统的实际测定结果一致。它们是完全不同的试验室, 由于实验内容不同,实验条件亦不相同,但使用本模型都准确地计算出了它们的实验结果，这足以说明本模型是基本正确的。
    论文中PCR产物数量直接使用了原子质量单位计算, 产物重量是由系统中分子个数与分子量的乘积计算的，它的误差主要来源于对分子个数的预测及产物分子量的计算。只要模型正确,计算的分子个数误差不大, 其结果误差就不会大。而在动力学的一般性验证中,需使用测定PCR产物的OD值, 通过OD值与核酸重量的关系计算产物的数量。因为核酸分子量不同,相同的OD值代表的核酸数量不同, 而且不同类型的模板、引物对测定OD值的干扰亦不同, 因此给使用一般的测定OD值方法计算产物数量验证动力学模型带来了一些困难。使用OD值直接计算产物数量时会得不到正确结论。目前一般使用1 OD=33微克DNA换算,使用这一参数换算与预测结果会相差约5倍, 当使用1 OD=25微克换算时,会相差约4倍。根据实际的PCR实验结果计算,对于400 bp左右的PCR产物, 使用1 OD=33微克换算时,乘以系数0.203,使用1 OD=25微克换算时,乘以系数0.268,计算结果与动力学预测的结果相符合。提示对于400 bp左右的PCR产物测定时，1 OD 仅相当6.7微克DNA 。我们做了大量的证实试验，结果是符合的。
    通过对PE公司7700仪器的数据资料及Saiki发表在《Science》上文中的数据计算证明了本模型的正确性。因此可以说建立的动力学模型是基本正确的。PCR技术涉及的对象一般情况下是大量分子的行为，它应符合一般的物理规律或统计规律，可以用一般的数学方法来描述。
    本数学模型只包括了一些主要的影响因素, 还有引物的特性、镁（Mg++）离子的影响等，目前尚无法以一个物理参数加入动力学模型中。本模型为准确的定量PCR技术奠定了理论基础。

    致谢：
    该工作得到沈倍奋、高杰英教授的协助，马晓星、于春宝等同志的帮助及医院科训科姜继传科长的大力支持，在此表示衷心的感谢。
    并特别感谢中国科学院人类基因组中心杨焕明主任在论文发表方面给予的大力支持。

    作者简介: 克丙申 (1947年) 男(汉族)、河南省荥阳县人,主任技师,从事免疫学与基因诊断方面的工作，在PCR、核酸序列分析、人白细胞抗原核酸序列基因分型技术（HLA SBT）技术方面有专长。

    参考文献（References）：
    [1] 黄培堂编译. ＰＣＲ技术的原理和应用 [M]. 北京：中国科学技术出版社，1990，12：1-9
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    [3] HA.艾利希主编. 田丁等，译. ＰＣＲ技术-DNA 扩增原理与应用[M]. 北京：北京医科大学中
    国协和医科大学联合出版社，1991，8：1-23
    [4] 沈同主编. 生物化学下册 [M]. 北京：高等教育出版社，1980，12：621-636
    [5] 沈同主编. 生物化学上册 [M]. 北京：高等教育出版社，1980，4：232-246
    [6] 克丙申等. 论辐射单扩散测定方法的数据处理 [J]. 上海免疫学杂志，1988，8（5）：372-373
    [7] 克丙申等. 微型计算机在临床免疫球蛋白测定中的应用 [J]. 医学检验杂志，1989，4
    （3）：19
    [8] 卢圣栋主编. 现代分子生物学实验技术 [M]. 北京：高等教育出版社，1993，7：75
    [9] Saiki RK,Scharf S,Faloona F, et al. Enzymatic amplification of β–globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia [J]. Science, 1985,230: 1350
    [10] Stolovitzky G. And Cecchi G. Efficiency of DNA replication in the polymerase Chain reaction [J]. Proe. Natl. Acad. Sci. 1996, V.93 : 12947-12952
    [11] Hoof T., Riordan J. R.,Tummler B. Quantitation of mRNA by the kinetic polymerase chain reaction assay: A tool for monitoring p-Glycoprotein gene expression [J]. Analytical Biochemistry 1991,196:161-169
    [12]克丙申、齐法莲、修方明等. PCR 动力学数学模型在PCR 产物直接核酸序列分析中的应用 [J]. 基础医学与临床 1997 17（5）：65—68

    Christian Ramakersa,b, Jan M. Ruijtera,*, Ronald H. Lekanne Depreza, Antoon F.M. Moormana
    Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data

    Christian Ramakersa,b, Jan M. Ruijtera,*, Ronald H. Lekanne Depreza, Antoon F.M. Moormana
    Christian Ramakers 2003年在神经科学文献 339期 62-66
    邮编： 250031
    通信地址：山东济南济南军区总医院免疫科
    姓名：克丙申、黄象艳
    联系电话： 0531- 2187681- 66960 （O）

    The Kinetic and Mathematical Model of PCR Amplification Experiment

    KE Bing-shen, HUANG Xiang-yan, CHEN Shi-min, CHEN Ying-jian, QI Fa-liang.
    Department of Immunology, General Hospital of Jinan Military Region, Jinan 250031 China


    Abstract: The PCR technique has been set up for nearly twenty years and is becoming more and more ripe. But because of the multiple influencing factors and complicated reaction procedures, no mathematical method that can describe the PCR reaction has been given. On the basis of its elementary principle, we suggested a kinetic equation to describe the reaction procedure, Wamp=[Ntarg×(1+P)nl+0.5×Cenz×U×P×Ceactive×(n-nl)-Ntarg×(1+n×P)]×Cu×M. This equation can describe correctly the accumulation rule of PCR product and thus build up the kinetic-mathematical model of PCR reaction. The predicted CT value of PE 7700 by the kinetic-mathematical model was in accordance with the real value detected by the machine. This kinetic-mathematical model accompanied by proper detecting equipment and computer could make an automatic PCR instrument, which would produce much better result. A laboratory can predict the amount of PCR product by this model and provide accurate information for further handling of PCR product according to its own condition. In this model, the molecular basis that PCR reaction is doomed to change from exponential amplification to linear amplification had been clarified.

    Key words: PCR PCR kinetic kinetic-mathematical model